Nature Genetics：颠覆传统！碱基编辑技术有望终结亨廷顿舞蹈症和弗里德赖希共济失调的进行性恶化

解锁遗传密码的“暂停键”——三核苷酸重复序列疾病的天然秘密

三核苷酸重复序列（Trinucleotide Repeat, TNR）疾病是一类由基因组中特定三核苷酸序列异常扩增并变得不稳定而导致的神经系统疾病。这些疾病的严重程度和发病年龄，往往与其出生时对应的重复序列长度紧密相关，重复序列越长，预后通常越差。例如，亨廷顿舞蹈症（HD）中的CAG重复序列扩增，以及弗里德赖希共济失调（FRDA）中FXN基因的GAA重复序列扩增，都是导致疾病的关键。目前，针对这些疾病，尚无获批的治疗方法能够阻止疾病的进展。

然而，大自然似乎早已为我们揭示了一线生机。研究发现，在正常人群中，甚至是一些携带较长致病性重复序列但未发病或发病较晚的个体中，这些重复序列内部常常天然存在着“中断”（Interruptions）。这些中断就像在一段冗长的重复乐章中，插入了几个不同的音符，巧妙地打破了重复的单调性。例如，亨廷顿舞蹈症（HD）患者基因中的CAG重复序列如果被同义的CAA三联体中断，疾病发病时间可以平均延迟约12年，甚至有研究表明可以延迟13-29年。对于弗里德赖希共济失调（FRDA），GAA重复序列中的GGA或GAG中断也与疾病症状减轻或发病延迟相关。这些天然存在的“暂停键”能够显著降低重复序列的不稳定性，抑制其在体细胞中的进一步扩增。这为我们提供了一个全新的治疗思路：既然天然中断具有保护作用，我们能否通过人工方式，精准地引入这些中断呢？

基因编辑的“利刃”——碱基编辑技术登场

传统的基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，通常会引起DNA双链断裂，这可能带来不可预测的基因组改变。而碱基编辑（Base Editing）则是一种更为精准的基因编辑技术，它能够在不引起DNA双链断裂的情况下，直接将基因组中的一个碱基对（Base Pair）精准地转换为另一个碱基对。这就像是在遗传密码的“书页”上，只修改一个“字母”，而不是撕掉一整页，极大地提高了编辑的精确性和安全性。

这项研究利用了两种主要的碱基编辑器：

胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE）： 能够实现C•G到T•A的转换。在本研究中，用于亨廷顿舞蹈症（HD）的CAG重复序列编辑，旨在将其中的CAG转换为CAA。

腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）： 能够实现A•T到G•C的转换。在本研究中，用于弗里德赖希共济失调（FRDA）的GAA重复序列编辑，旨在将其中的GAA转换为GGA或GAG。

通过设计，这些碱基编辑器可以模仿自然界中存在的稳定、非致病性等位基因（Alleles）中的中断，将致病性重复序列的“单调”打破。

亨廷顿舞蹈症的“静默舞者”——CAG重复序列的精准编辑

亨廷顿舞蹈症（HD）是一种由HTT基因中CAG重复序列扩增引起的进行性神经退行性疾病，导致运动、认知和精神障碍。研究人员的目标是引入CAA中断，将“致病性舞蹈”变为“静默舞者”。

体外细胞实验的振奋成果

研究首先在人类细胞（HEK293T细胞和HD患者来源的成纤维细胞）中验证了CAG-CBE的有效性。研究人员优化了胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的策略，发现名为EA-evoA-32NLS的编辑器表现出最高的编辑效率（64±4.8%），同时具有最高的靶向产物纯度（81:1）。

在亨廷顿舞蹈症（HD）患者来源的成纤维细胞系中（这些细胞携带48-180个CAG重复序列的致病性HTT等位基因），通过信使RNA（mRNA）电穿孔（Electroporation）导入碱基编辑器和引导RNA（sgRNA）。在电穿孔5天后，观察到：

高达66-82%的已处理细胞中的致病性CAG重复序列中引入了中断。

编辑效率在长的致病性HTT等位基因上比短的野生型等位基因高出约1.1-1.3倍，表明长的重复序列提供了更多的编辑机会。

通过长期培养这些细胞，观察到未经处理和模拟编辑的细胞在30天后，CAG重复序列大小显著增加，最常见的CAG等位基因增加了约6个重复单元。

然而，经过CAG-CBE处理的HD成纤维细胞，在30天后未表现出重复扩增，最常见的CAG等位基因反而减少了约5个重复单元。这表明，引入中断不仅可以阻止扩增，甚至能促进致病性重复序列的缩短。

小鼠体内验证：CNS中的显著改善

为了评估CAG-CBE在体内的效果，研究人员使用了Htt.Q111亨廷顿舞蹈症（HD）小鼠模型。这种小鼠携带人源化HTT等位基因，包含约109-122个CAG重复序列，并在中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中表现出年龄依赖性体细胞不稳定性。

研究人员通过AAV9病毒载体递送优化后的CAG-CBE（EA-evoA-32NLS-NG和sgCTG）至Htt.Q111新生小鼠大脑侧脑室（ICV）中。

转导效率： AAV9病毒在皮层（Cortex）的平均转导效率达到50±10%，在纹状体（Striatum）达到31±12%，这与早期AAV9研究报告一致。

编辑水平： 给药4周后，小鼠皮层细胞中约有24±1.6%的等位基因被引入CAA中断，纹状体细胞中约有5.6±1.2%。这一比例在12周后持续增加，皮层达到33±8.3%，纹状体达到22±3.0%。到24周时，皮层中编辑等位基因的比例稳定在34±6.0%，纹状体为26±6.0%。这意味着，在被转导的GFP阳性细胞核中，到24周时，皮层和纹状体中分别有约**76±12%和72±13%**的HTT等位基因携带一个或多个CAA中断。

对重复扩增的影响： 研究人员对CAG重复序列长度进行了定性和定量分析。结果显示，与对照组相比：

在给药12周后，CAG-CBE治疗显著降低了皮层中CAG重复序列的平均大小（不稳定指数ICAG减少了约1.6±0.5个重复单元，P=0.0064），纹状体减少了约2.8±0.5个重复单元（P=0.0009）。

到给药24周后，这种效果持续存在，皮层中ICAG减少至约2.2±0.9个重复单元（P=0.0265），纹状体减少至约5.4±0.9个重复单元（P=0.0003）。

这些数据明确证实，在亨廷顿舞蹈症（HD）小鼠模型中，通过AAV9递送碱基编辑器能够有效在中枢神经系统（CNS）中引入CAA中断，从而显著减少致病性HTT基因CAG重复序列的体细胞扩增。

弗里德赖希共济失调的“基因重构”——GAA重复序列的创新干预

弗里德赖希共济失调（FRDA）是最常见的遗传性共济失调，由FXN基因内含子（Intron）中GAA重复序列扩增引起，导致frataxin蛋白表达不足。该研究旨在引入GGA或GAG中断，实现“基因重构”。

体外细胞实验：功能恢复的曙光

研究首先在人源细胞（HEK293T细胞和FRDA患者来源的成纤维细胞）中评估了GAA-ABE的编辑效果。

编辑效率： 在携带9个GAA重复序列的HEK293T细胞中，使用AGAA PAM的ABE8e-Cas9-NRCH和ABE8e-Cas9-NG策略显示出最高的编辑效率，分别达到42±2.9%和46±2.0%。

在FRDA患者来源的成纤维细胞（携带约330/380或541/420个GAA重复序列的致病性FXN等位基因）中，通过信使RNA（mRNA）电穿孔（Electroporation）导入ABE8e-dNRCH和sgGAA。

中断引入： 5天后，对照成纤维细胞（8或9个GAA重复序列）中平均有20±7.0%的重复序列引入中断，而FRDA患者细胞中，分别有33±12%和32±9.5%的等位基因引入中断。编辑效率与重复序列长度呈正相关，重复序列越长，编辑机会越多。

FXN mRNA表达： 碱基编辑治疗使FRDA成纤维细胞中FXN mRNA的表达量增加了约1.5倍，从对照水平的约49%提高到约74%。这表明，引入中断能够减轻FXN基因的转录抑制，部分恢复分子功能。

小鼠体内验证：阻止体细胞扩增的里程碑

为进一步验证GAA-ABE在体内的治疗潜力，研究人员使用了YG8s小鼠模型。这些小鼠携带人源FXNYAC转基因，分别有约300和800个GAA重复序列，并在体细胞中表现出年龄依赖性扩增倾向。

研究人员通过AAV9病毒载体递送优化后的GAA-ABE（ABE8e-dNRCH和sgGAA）至YG8s新生小鼠大脑侧脑室（ICV）中。

编辑水平： 在给药24周后，YG8s.300小鼠的皮层等位基因中，估计有28±6.8%被编辑（其中5.6%±0.8%直接观察到），YG8s.800小鼠中估计有55±14%被编辑（其中5.5%±2.9%直接观察到）。编辑产物主要为GAA到GGA的转换（YG8s.300小鼠中66±2.9%，YG8s.800小鼠中56±4.0%）。

对重复扩增的影响： 与对照组相比，AAV9-ABEDCH治疗显著降低了小鼠皮层中GAA重复序列的平均大小：

YG8s.300小鼠中GAA重复序列平均大小减少了约4.9±0.6个重复单元（P<0.0001）。

YG8s.800小鼠中GAA重复序列平均大小减少了约7.2±1.2个重复单元（P<0.0001）。

抑制扩增与促进收缩： AAV9-ABEDCH还显著减少了体细胞重复扩增（YG8s.300小鼠中的扩增指数IGAA(e)减少了约2.9±0.6个重复单元，P=0.0002；YG8s.800小鼠中减少了约5.2±0.9个重复单元，P=0.0003），同时促进了重复序列的收缩。

这些数据表明，碱基编辑不仅能稳定致病性GAA重复序列，还能诱导其收缩，这在体外和体内模型中均得到了证实。

潜在风险与未来展望——安全性与临床转化

尽管碱基编辑技术展现了巨大的潜力，但任何基因编辑疗法都必须严格评估其安全性，特别是脱靶效应（Off-target Editing）。脱靶编辑是指碱基编辑器在基因组中非预期的位置引入的改变。

脱靶编辑分析：精准与挑战并存

研究人员对两种碱基编辑策略（CAG-CBE和GAA-ABE）进行了全基因组脱靶分析。

CAG-CBE的脱靶： 在HEK293T细胞的全基因组测序（WGS）中，研究人员发现约48%的CIRCLE-seq预测位点（即可能被编辑的区域）发生了胞嘧啶碱基编辑（编辑水平大于0.5%），其中有1240个位点编辑水平达到或超过5%。这些脱靶编辑位点中，约28%位于蛋白质编码区（Protein-coding Exons），其中约145个基因发生了同义（Synonymous）密码子替换，约91个基因发生了错义（Missense）突变（平均约26%的等位基因）。重要的是，错义突变主要导致良性氨基酸变化（87%），仅少数基因（如TSHZ3）可能影响蛋白质功能，极少数导致无义（Nonsense）突变。

GAA-ABE的脱靶： 在HEK293T细胞的全基因组测序（WGS）中，约50%的CIRCLE-seq预测位点发生了腺嘌呤碱基编辑（编辑水平大于0.5%），其中约有5085个位点编辑水平达到或超过5%（总预测位点的约12%）。与CAG-CBE不同，GAA-ABE的脱靶位点中，绝大多数（超过98%）位于非编码区（Non-coding Regions），仅约1.6%（83个）的位点位于蛋白质编码区。在编码区受影响的基因中，约57个发生了非同义替换，其中29个在神经元中表达。AlphaMissense预测大多数错义突变（36个基因）是良性的。

总的来说，碱基编辑引入的C•G>T•A和A•T>G•C改变，大部分是非编码或同义的，或者能再现天然的等位基因变异。少数可能影响蛋白质功能的脱靶位点需要进一步研究，以全面评估其潜在的生物学后果。这强调了实验验证全基因组脱靶效应的重要性，不能仅仅依赖计算预测模型。

通往临床的征途

尽管本研究取得了显著突破，但仍面临一些挑战和未来的研究方向：

疾病模型局限性： 本研究使用的Htt.Q111和YG8s小鼠模型，在运动和行为表型上与人类患者存在差异。未来的研究应使用更接近人类疾病表型的模型（如Q140亨廷顿舞蹈症小鼠或FXN基因敲除背景下的FRDA小鼠），以更全面地验证疗法的有效性。

递送效率与范围： AAV9病毒主要靶向中枢神经系统的神经元。而弗里德赖希共济失调（FRDA）还涉及非神经元组织（如胶质细胞）和心脏（心肌病）。未来需要探索其他AAV血清型或递送方式，以实现更广泛的组织靶向，尤其是在晚期疾病模型中。

长期安全性： 碱基编辑器的长期表达可能导致脱靶事件的累积。需要进行长期的随访研究，评估治疗后基因组变化的动态以及其对细胞功能和整体健康的影响。研究还需进一步优化碱基编辑器，减少Cas依赖性和Cas非依赖性脱靶。

临床转化： 这项研究的发现为三核苷酸重复序列疾病的治疗提供了概念验证，并支持了通过引入中断来减轻致病性重复扩增的治疗策略。未来的工作将聚焦于将这些创新性技术从实验室推向临床应用，最终造福广大患者。

这项突破性研究成功展示了碱基编辑技术在小鼠和患者细胞中精准纠正三核苷酸重复序列扩增的潜力。通过引入天然存在的“中断”，不仅能抑制致病性重复序列的扩增，甚至能促使其缩短，为亨廷顿舞蹈症（HD）和弗里德赖希共济失调（FRDA）等严重神经退行性疾病的治疗带来了前所未有的希望。这不仅是基因编辑领域的一大步，更是人类对抗遗传疾病征程中的一个里程碑。

未来，随着技术的不断完善和深入研究，我们有理由相信，这些曾经束缚生命的基因枷锁终将被一一解除，让更多患者重获健康与自由。